细菌耐药表型的检测

　 （一）β-内酰胺酶的测定

1.产色头孢菌素法  该法的原理是头孢硝噻吩被β-内酰胺酶水解后由黄色变为红色，对β-内酰胺酶来说本方法最敏感。通常显示时间为1～2分钟，如果酶活性弱，显色时间相应延长。如果显示时间超过10分钟，可能是青霉素蛋白引起的不良反应。

   2.生物学方法  以对青霉素高度敏感的枯草杆菌或藤黄微球菌为指示菌，按药敏试验方法涂布于M-H琼脂平板上，平板中间放置一青霉素药敏纸片（1U），取较多待测菌由药敏纸片边缘向培养皿边缘划线接种。35℃放置24h后观察。如果待测菌株产生β-内酰胺酶，指示菌就能在接近药敏纸片处生长。本方法对产生青霉素酶的葡萄球菌很敏感，对革兰阴性杆菌产生的与细胞结合的β-内酰胺酶敏感性较差。

3.碘测定法  用接种环挑取受试菌落数个混于青霉素溶液中，室温下振荡30分钟。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振摇。若检测菌产酶，则可水解青霉素β-内酰胺环变为青霉素噻唑酸，后者与碘结合，使碘淀粉复合物转变为无色，10分钟之内蓝色消失者为产酶株。

4.产酸法  产酸法所用底物为青霉素，将试验菌种入含底物的枸橼酸缓冲液中，试验菌所产生的β-内酰胺酶可将青霉素水解为青霉素噻唑酸，使溶液的pH降低，溶液中的指示剂酚红即由红色（阴性）变为黄色（阳性）。

  【评价】

测定β-内酰胺酶的方法由多种，曾使用的方法有碘测定法、酸测定法、产色头孢菌素法、生物学方法等。头孢菌素法特异性强，影响因素少，临床应用较广泛。

　（二）超广谱β-内议酶的检测

超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lacta-mases，ESBLs）是指由质粒介导，能水解所有青霉素类、头孢菌素类和单环β-内酰胺类抗菌药物。ESBLs不能水解头霉素类和碳青酶烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦等β-内酰胺酶抑制剂所抑制。

1.初筛试验  若纸片扩散法抑菌圈直径头孢泊肟≤17mm、头孢他淀≤22mm、氨曲南≤27mm、头孢噻肟≤27mm、头孢曲松≤25mm，可疑有ESBLs的产生。

2.确证试验  头孢他啶、头孢他啶／棒酸、头孢噻肟、头孢噻肟／棒酸，任何一个药物与棒酸复合药的抑菌圈，比不加棒酸的单药的抑菌圈的差值≥5mm，判定为产ESBL。

【评价】

由于ESBLs酶种类繁多，赋予不同底物的耐药水平不尽相同，因此，CLSI对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、无菌体液分离出的奇异变形杆菌中ESBLs的初筛和表型确证试验做了推荐。

　（三）AmpC酶检测

AmpC酶是在革兰阴性杆菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的Ⅰ型β-内酰胺酶。

1.产染色体AmpC酶细菌的检测  有些细菌产生的AmpC酶基因位于染色体上，具有可诱导性，细菌不接触β-内酰胺类抗生素时，产生的酶量很低，环境中存在有诱导作用的抗生素时，产酶量显着上升。这类酶最有效的诱导物是对酶有稳定作用的亚胺培南、头孢菌素类和部分三代头孢菌素。检测这类酶通常用头孢西汀纸片作为诱导剂，以头孢噻肟或头孢呋辛作为指示剂。将细菌按K-B法涂布于MH培养基上，贴上头孢西汀或亚胺培南药敏纸片，在距前者15～20mm处放置头孢噻肟或头孢呋辛纸片。35℃培养过夜后，两纸片邻近的一侧抑菌圈出现平钝现象即为阳性。

2.产质粒型AmpC酶细菌检测  质粒型AmpC酶检测一般用三维试验。它是以纸片扩散法为基础发展起来的一种方法，试验中纸片上的药物向琼脂中扩散为第一维，细菌产生的β-内酰胺酶向琼脂中扩散为第二维，用刀片在纸片边缘做一凹槽，并注入待检菌液，菌液中细菌产生的β-内酰胺酶向琼脂中扩散形成第三维。这种方法可以检测质粒型AmpC酶和持续高产染色体AmpC酶。将0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922菌悬液均匀涂布于M-H琼脂表面，用头孢西汀纸片贴于平皿中心，在距纸片5mm处，用刀片放射形由里向外划一道狭缝，取40ul的酶粗提取物加入狭缝中，35℃培养过夜。抑菌圈与狭缝交界处出现缺损即为AmpC酶阳性。

  【评价】

AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素如头孢吡肟敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。AmpC酶的表达与调控与AmpC、AmpR、AmpD、AmpG基因有关。